菌落總數(shù)測(cè)定操作步驟及注意事項(xiàng)

一、測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)

參考食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

二、操作過(guò)程

1、前期準(zhǔn)備：

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，提前準(zhǔn)備好要用的平板計(jì)數(shù)瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等，相應(yīng)的材料進(jìn)行滅菌處理（干熱滅菌或高壓滅菌）。

2、接收樣品：

收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好，登記樣品信息，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在取樣時(shí)取出。

3、樣品處理：

按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)操作，仔細(xì)閱讀實(shí)驗(yàn)要求。一般實(shí)驗(yàn)室收到的是干粉樣品、固體樣品、或者液體樣品等。假如收到干粉樣品，那么首先需要將其配置成水溶液（即水化）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行預(yù)判，預(yù)估稀釋液倍數(shù)，溶解即可。

4、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

4.1實(shí)驗(yàn)操作最好在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作，需要把超凈臺(tái)或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌。

4.2提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺(tái)上紫外殺菌。

5、實(shí)驗(yàn)操作：

5.1稀釋

將樣品從冰箱中取出達(dá)到室溫后開(kāi)始取樣，在超潔凈臺(tái)或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無(wú)菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進(jìn)行洗滌并全部轉(zhuǎn)入無(wú)菌瓶或袋中。

洗滌轉(zhuǎn)移時(shí)注意樣品瓶蓋的清洗和無(wú)菌操作，將全部的水化液進(jìn)行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進(jìn)行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1ml無(wú)菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類(lèi)推。再將幾個(gè)稀釋度的樣液接種到提前做好標(biāo)記的無(wú)菌平皿中。

5.2傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至46℃的平板計(jì)數(shù)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。傾注過(guò)程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開(kāi)30°左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺(tái)面上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。

5.3觀察計(jì)數(shù)

24h觀察檢測(cè)結(jié)果有無(wú)異?，F(xiàn)象，是否有蔓延菌落出現(xiàn)。48h再按照GB 4789.2的要求進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。在對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析后，選取檢測(cè)結(jié)果的平均值為最終數(shù)據(jù)。

三、注意事項(xiàng)

1、當(dāng)無(wú)法預(yù)判樣品菌落總數(shù)含量時(shí)，需要梯度稀釋?zhuān)瞬襟E尤其關(guān)鍵，必須盡可能地減少誤差。

2、傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過(guò)高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過(guò)低瓊脂易凝固，不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴條件，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

3、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過(guò)厚會(huì)影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。

4、傾注過(guò)程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來(lái)。

5、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時(shí)要盡可能放在中央部位，然后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

6、瓊脂培養(yǎng)基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時(shí)要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

7、冷卻的過(guò)程不要著急，冷卻充分后再倒置放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，放置的時(shí)候要盡量避免放到風(fēng)機(jī)口處，每摞不要超過(guò)6個(gè)平皿。

8、檢測(cè)結(jié)束后所有的稀釋液樣品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以備實(shí)驗(yàn)出錯(cuò)時(shí)再用。

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